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Isca1心肌特异性基因敲除SD大鼠

Isca1心肌特异性基因敲除SD大鼠

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Isca1心肌特异性基因敲除SD大鼠

        心力衰竭,简称心衰,是指由于心脏收缩和(或)舒张功能障碍,无法将静脉回心血量充分排出心脏,导致静脉系统血液淤积,动脉系统灌注不足,从而引发心脏循环障碍症候群,心衰并不是一个独立的疾病,而是所有心血管疾病发展的终末阶段。
       近年来,随着我国社会老龄化和高血压,冠心病等心血管疾病发病率的增加,使得心衰呈现高发病率,高致残率和高死亡率的特点,《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%,有1000万左右的心衰患者。
       几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生,而在基础性心脏病的基础上,一些因素亦可诱发心衰的发生,常见诱因包括,感染,严重心律失常,心脏负荷增大,药物中毒(如洋地黄)等等。
       心衰在临床上可分为急性心衰和慢性心衰。临床表现,包括呼吸困难,运动耐力下降,心室腔增大,心脏功能下降(LVEF<40-50%),心脏顺应性降低,心室腔内淤血,肺循环及体循环淤血。
临床检查手段,包括超声影像分析,心电图,心衰标志物(B型利钠肽(BNP),N末端B型利钠肽原(NT-proBNP))心肌坏死标志物(心肌肌钙蛋白T(cTnT)及心肌肌钙蛋白I(cTnI))。
临床治疗方法,包括强心(米力农,地高辛),利尿(速尿),抗感染,改善心肌重构(卡维地洛)及心脏移植。
       Isca1是最近发现的多发性线粒体功能障碍综合征(MMDS)的致病基因,目前已有研究发现Isca1在线粒体以及胞质铁硫簇生物合成过程中起重要作用,而铁硫簇最重要的生物学功能是作为电子传递蛋白的辅助基团参与能量转移。
       所以推测Isca1基因对机体线粒体功能及能量代谢进程具有重要作用,而心脏作为机体内重要高耗能脏器,Isca1基因对心脏发育,能量代谢及病理进程可能具有重要作用。
目前还没有该基因心肌特异性敲除大鼠模型的建立及研究报道,所以特构建该模型大鼠,以分析Isca1基因对心脏发育的影响及其生物学功能,为新的心肌能量代谢异常和由心肌线粒体功能障碍导致的心衰大鼠模型的建立提供实验依据。
       利用Cre/loxP重组系统的原理,进行条件性敲除(Conditional knockout,CKO),制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1flox/+大鼠,使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交,经两轮杂交最终获得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠,并使用PCR方法进行基因型鉴定,使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。
1 Isca1条件性敲除大鼠模型的建立
(1) 设计方案

         根据3.1.5.1获得Isca1flox/+大鼠F1代后,首先通过8周龄左右Isca1flox/+与野生型大鼠进行杂交,获得一定数量的Isca1flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠(SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS,http://www.ratresource.com)进行杂交,得到Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交,可得到Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠,即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠,用于后续实验。

       利用Cre/loxP重组系统的原理,进行条件性敲除(Conditional knockout,CKO),制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1flox/+大鼠,使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交,经两轮杂交最终获得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠,通过PCR方法进行基因型鉴定心肌组织特异性Isca1敲除大鼠基因型。免疫印迹Western blot方法鉴定Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠ISCA1蛋白的敲除效率达90%以上(图3)。

图3 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠模型基因型鉴定及基因蛋白表达水平鉴定
4 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠生存率分析
        为观察心肌组织特异性Isca1敲除大鼠子代基因型及生存率情况,将 Isca1flox/+大鼠与MHC-Cre大鼠经两代杂交,得到野生型(WT)、心肌特异性Isca1敲除大鼠杂合子(Isca1flox/+/MHC-Cre)和心肌特异性Isca1敲除大鼠纯合子(Isca1flox/flox/MHC-Cre)幼崽,根据孟德尔定律,上述基因型比例应为5:2:1,实验结果显示,累积统计幼崽共127只,其中WT幼崽74只,Isca1flox/+/MHC-Cre 幼崽37只,Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽16只,经计算可得子代中野生型、杂合子型、纯合子型三种基因型幼崽出生比例基本符合孟德尔定律(图4)。对三种基因型子代进行生存率分析显示,子代中WT和Isca1flox/+/MHC-Cre幼崽生存正常,生存率为100%,Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽7~10天全部死亡,至11天生存率为0%(图4)。

注:(A)Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠杂交后,出生子代基因型情况统计。(B)Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠杂交后,WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre子代生存率统计。
5 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏重量/体重比分析
        使 Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠杂交,于子代出生后6.5天对WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre(CKO)子代进行大体形态观察并计算心脏重量与体重之比(heart weight/body weight,HW/BW)。实验结果,与野生型相比,6.5 d CKO大鼠呼吸虚弱,处于濒临死亡状态(图5),并且心脏外观出现明显肥大。6.5 d CKO大鼠HW/BW平均值±标准差为(8.11 ± 1.85)mg/g,较6.5 d WT大鼠(平均值±标准差为(6.50 ± 1.01) mg/g)显著增加,有显著性差异(图5,*P<0.05)。

       为分析心脏结构与功能状态改变,本研究通过M型超声心动图检测6.5 d 野生和心肌组织特异性敲除大鼠心脏的结构和功能。发现与同窝WT大鼠相比,6.5 d KO大鼠射血分数大幅下降,左心室内径明显增大,伴随室壁变薄,表现为收缩无力,心室严重扩张,已出现心功能下降、严重心衰的症状。

       注:左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVID;d);左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter,LVID;s);射血分数(ejection fraction,EF);短轴缩短率(fractional shortening,FS);舒张期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall; diastolic,LVPW;d);收缩期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall; systolic,LVPW;s);舒张期左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall; diastolic,LVAW;d);收缩期左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall; systolic,LVAW;s)。*P<0.05,**P<0.01,versus同窝WT大鼠。
7 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌纤维及线粒体形态观察
       为进一步分析心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌纤维和线粒体形态改变,取6.5 天WT和心肌组织特异性Isca1敲除大鼠,摘取心脏,取左心室2 mm×2 mm大小新鲜组织,使用电镜专用固定液进行固定,制备电镜样本并进行观察。结果显示,WT大鼠心肌纤维排列整齐,肌节和Z线清晰,心肌内线粒体多呈圆形或椭圆形,线粒体双层膜膜结构清晰,嵴致密。而6.5 天心肌组织特异性Isca1大鼠敲除心肌纤维出现断裂,肌节和Z线严重模糊,部分位置纤维已溶解,心肌内线粒体膜结构受损,线粒体内嵴结构消失,线粒体肿胀及空化严重(图6)。

       Isca1是最近发现的多发性线粒体功能障碍综合征(MMDS)的致病基因,目前已有研究发现Isca1在线粒体以及胞质铁硫簇生物合成过程中起重要作用,而铁硫簇最重要的生物学功能是作为电子传递蛋白的辅助基团参与能量转移。
      所以推测Isca1基因对机体线粒体功能及能量代谢进程具有重要作用,而心脏作为机体内重要高耗能脏器,Isca1基因对心脏发育,能量代谢及病理进程可能具有重要作用。
      然而,目前还没有该基因心肌特异性敲除大鼠模型的建立及研究报道,所以特构建该模型大鼠,以分析Isca1基因对心脏发育的影响及其生物学功能,为新的心肌能量代谢异常和由心肌线粒体功能障碍导致的心衰大鼠模型的建立提供实验依据。
       已构建成功的心肌特异性敲除纯合子大鼠模型,出生后7-10天即陆续死亡,至出生后11天生存率为0%,至6.5天时小鼠心脏整体扩张严重,心功能下降显著,表现为严重心衰症状,心肌纤维断裂溶解,心肌线粒体肿胀,嵴消失,空化严重。推测该模型大鼠由Isca1基因缺失后导致线粒体功能障碍,进而引发心衰及死亡。
该模型对于Isca1基因的生物学功能研究,特别是其对心肌线粒体功能的影响及机制分析提供了工具动物,并且可成为由心肌线粒体功能障碍导致心衰的工具动物模型。但是该动物模型发病较早,限制了部分实验的实施和后续研究。
参考文献
杨辛兰,吕丹,张旭,董伟,陈炜,高珊,高凯,史旭东,马元武,张连峰. 心肌组织特异性Isca1敲除造成新生大鼠心脏结构异常[J].中国实验动物学报. 2019, 27(3): 286-290.